蛋白質(zhì)穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是生物技術藥物重要的關鍵質(zhì)量屬性之一，它決定了生物藥物的藥效、生產(chǎn)可行性、安全性及保質(zhì)期。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性確保了蛋白質(zhì)在其貨架壽命期內(nèi)保持活性和安全。

穩(wěn)定性研究被用來確認蛋白質(zhì)在不同條件下高級結(jié)構(gòu)HOS(High Order Structure)的穩(wěn)定性，如溫度、pH值、輔料成分及儲存時間等，以確定適宜的存儲和運輸條件。同時，監(jiān)管機構(gòu)如FDA、EMA等在授權(quán)生物藥使用批準之前也要求廣泛的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。因此，理解和確保治療性蛋白質(zhì)藥物的高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是生物制藥企業(yè)開發(fā)安全有效藥物的必要條件，研究人員需要在研發(fā)和生產(chǎn)的多個階段對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進行分析和評估。

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常見分析方法

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性分析通常會使用以下方法進行研究：

生化方法

圓二色譜(CD，Circular Dichroism Spectroscopy)

差示掃描量熱法(DSC)

定量PCR(qPCR)技術(外源熒光DSF)

動態(tài)光散射(DLS)與靜態(tài)光散射(SLS)方法

差示掃描量熱法(DSC)法常常被做為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析最重要的的解決方案，然而，由于對儲存于微孔板(如96或384孔板)上的大量樣品的快速分析需求，使得DSC在藥物篩選和早期開發(fā)中的應用受到一定的限制。因此，DSF(內(nèi)源熒光法)已成為一種流行且具有成本效益的解決方案。

DSF(內(nèi)源熒光法)無需對待測樣品進行任何標記，也無需使用任何熒光探針，即可快速測量整塊樣品微孔板，并提供高通量數(shù)據(jù)以幫助樣品候選物和配方成分的篩選。

DSF法快速篩選大量樣品，大大提高了藥物篩選、成藥性分析的效率，分析結(jié)果與DSC技術互相正交驗證。對很多生物技術藥物而言，利用DSF方法做為快速大量篩選，使用DSC技術來正交驗證DSF的早篩結(jié)果，是藥物篩選和藥物開發(fā)的一個有效方案。

DSF技術原理：

差示掃描熒光法(DSF)是一種經(jīng)濟高效且易于使用的生物物理技術，它通過檢測當溫度升高或變性劑存在時熒光發(fā)射光譜的相應變化來確定蛋白質(zhì)的變性轉(zhuǎn)變溫度(熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值或化學變性Cm值)。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時(如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內(nèi)源熒光的最大發(fā)射光譜會發(fā)生位移。蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸內(nèi)源熒光強。

以色氨酸為例，在蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)核微環(huán)境中，其內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長在330nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長則出現(xiàn)在350nm左右。蛋白質(zhì)熱變性或者化學變性通常會導致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導致內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域移動。

這種監(jiān)測色氨酸內(nèi)源熒光變化的方法無需熒光探針或者標簽，避免了傳統(tǒng)外源熒光DSF中背景熒光以及非特異吸附等假陽性結(jié)果。

當?shù)鞍踪|(zhì)由于熱變性或者化學變性劑(如鹽酸胍、尿素等)作用而發(fā)生去折疊時，測量內(nèi)源熒光隨溫度或者變性劑的變化來就可以研究蛋白質(zhì)的展開過程。這些變化的數(shù)據(jù)可以用于生成熔解曲線，并獲取表觀熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值、Tonset、范德華焓變(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)、化學變性Cm值等用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的評估和預測。

傳統(tǒng)DSF經(jīng)常使用350/330比值法來進行數(shù)據(jù)分析，而SUPR-DSF提供了多種分析方法，除了比值法外，SUPR-DSF還提供了BCM(Barycentric mean,質(zhì)心均值法)，可以得到比350/330比值法更好的信噪比，同時更有利于低濃度蛋白樣品的分析。

高通量差示掃描熒光儀SUPR-DSF系統(tǒng)的主要特點：

采用標準的384微孔板，無需特殊的耗材和毛細管

高通量篩選，一個升溫過程（60-80分鐘）內(nèi)可完成

單塊384微孔板的測試利用內(nèi)源熒光，無需染料或標簽，兼容常用生物體系UV LED激發(fā)配合全光譜檢測

僅需要10-30μl樣品，樣品濃度0.05~250mg/mL

獲得關鍵參數(shù)：Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及親和力等

提供嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)質(zhì)量和可重復性

高通量差示掃描熒光儀SUPR-DSF系統(tǒng)的應用：

SUPR-DSF系統(tǒng)廣泛應用于生命科學基礎研究和藥物研發(fā)等多個領域：

加速突變體的篩選

配方和預配方的篩選和優(yōu)化

蛋白結(jié)晶條件篩選

批間一致性評估

生物相似性評估

加速應力和強制降解研究

結(jié)合誘導的構(gòu)象變化分析

翻譯后修飾評估

恒溫和化學穩(wěn)定性分析

SUPR-DSF系統(tǒng)的技術規(guī)格：

典型應用案例--加速突變體的篩選

使用SUPR-DSF對16個樣品進行比較和篩選，其中包括1個野生型蛋白(WT)和15個單點突變體。在1.5小時內(nèi)，DSF儀器生成了48個樣本(每組3次重復)的高質(zhì)量熔解曲線(相同時間內(nèi)最多可生成384孔的數(shù)據(jù))。用模型對數(shù)據(jù)進行擬合，可獲取熔解溫度Tm值并對穩(wěn)定性進行排序和篩選。

如圖1所示，與WT(藍色)相比，其中3個突變體(9、13和14)的熔解曲線左移，說明其蛋白穩(wěn)定性降低；余下12個突變體的穩(wěn)定性均有所提高。其中，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提升最大。

圖2展示了幾個代表性樣本的熔解曲線，可以發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)發(fā)生了單一熱轉(zhuǎn)變過程(WT蛋白與突變體7和8)，而另一些蛋白質(zhì)(突變體1和14)則清楚地顯示出兩段熱轉(zhuǎn)變過程，即熔解曲線上有兩個拐點。通過SUPR-DSF提供的數(shù)據(jù)，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進行深入研究。

精確解析單抗的Fab區(qū)域

使用SUPR-DSF獲得NISTmAb(NIST單抗標準品)的差示掃描熒光數(shù)據(jù)，并將結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)所獲得的數(shù)據(jù)進行比較。SUPR-DSF可以解析NISTmAb所有的三個結(jié)構(gòu)域:CH2(69°C)，CH3(83°C)，和Fab區(qū)域(94°C)。SUPR-DSF的最高掃描溫度為105°C，可以精確測量異常穩(wěn)定的Fab區(qū)域熔解溫度，而其他DSF平臺的掃描最高溫度一般僅為95°C，容易丟失單抗Fab區(qū)域去折疊變性的重要信息(圖5(a))。

將SUPR-DSF歸一化后的數(shù)據(jù)與DSC結(jié)果進行比較。如圖5(b)所示，三個峰相互匹配，證明了兩種技術良好的一致性，使用SUPR-DSF可以輕松獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性信息。

典型應用案例--加速曲妥珠單抗的輔料和配方篩選

生物治療藥物如抗體等的配方是保證藥效、生產(chǎn)可行性和安全性的基礎，也決定了儲存和運輸?shù)臈l件。制藥企業(yè)亟需高通量的方法來快速可靠地篩選大量的條件組合，以確定最佳配方。

使用SUPR-DSF，研究者對治療性抗體曲妥珠單抗在96種不同條件下的穩(wěn)定性進行了篩選和分析，并在1.5小時內(nèi)完成了測試。測試結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)的結(jié)果非常一致。如果集成實驗室自動化設備，每天可以完成數(shù)千個樣品的篩選。

DSF熔解曲線顯示出兩個獨立的轉(zhuǎn)變區(qū)域，通過最小二乘法對數(shù)據(jù)進行擬合，可以確定Tonset值、Tm值和范德華焓變(△H)。圖3(a,b)分別展示了破壞/增強穩(wěn)定性的輔料的熔解曲線及擬合圖。圖4(a)列出了能夠提高抗體穩(wěn)定性的所有輔料(與對照樣品相比)。

SUPR-DSF正確鑒別了已上市的曲妥珠單抗中使用的輔料組氨酸和海藻糖的穩(wěn)定性作用，如圖4(b)所示，SUPRDSF數(shù)據(jù)具有出色的可靠性和一致性，同時提供驚人的高通量。

利用高通量差示掃描熒光法獲得結(jié)合參數(shù)

結(jié)合分析研究是藥物研發(fā)的一個關鍵領域，相互作用的特征和KD值(解離平衡常數(shù)，表征分子間結(jié)合的親和力)對候選物的選擇是至關重要的，研究者需要采用多種原理互補的方法來篩選和確定文庫中的數(shù)千種至數(shù)萬種小分子化合物。

通過SUPR-DSF進行分子相互作用分析，不受表面效應、物質(zhì)遷移(mass transport)或緩沖液折光率問題等因素的影響，可在分析物結(jié)合濃度范圍內(nèi)提供高通量、無需標記的測量。

通過檢測蛋白質(zhì)-配體復合物的穩(wěn)定性變化，可用于確認結(jié)合的特異性；通過熱變性時熒光發(fā)射光譜的變化和配體濃度的函數(shù)關系可以計算KD值。即使對于非常弱的結(jié)合分子，結(jié)合所誘導的穩(wěn)定性變化也能被SUPR-DSF檢測到。

使用標準384微孔板，能夠在一天內(nèi)篩選數(shù)千個樣品的穩(wěn)定性，從而確認結(jié)合狀態(tài)。

使用SUPR-DSF研究配體(TFMSA)與人碳酸酐酶I的結(jié)合作用，碳酸酐酶隨TFMSA濃度變化的熔解曲線如圖6所示。

圖7顯示了人碳酸酐酶I的Tm值與TFMSA濃度的關系，擬合所獲得的KD值有兩個，分別為2.1μM和174.2μM，與

文獻中的數(shù)值一致，證明SUPR-DSF可以用作配體結(jié)合研究的預篩選或確認工具，并且具有靈敏度。

直觀簡明的軟件

SUPR-DSF軟件提供直觀、簡潔、智能、高效的實驗設計與數(shù)據(jù)分析功能，既可以讓初學者快速上手，又可為經(jīng)驗豐富的資深用戶提供多種進階選項。

關于ProteinStable

為Applied Photophysics的子公司，旨在將以客戶為中心的技術引入蛋白質(zhì)篩選和表征市場，重點是高通量、低樣品量的蛋白質(zhì)表征方法，在不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量的條件下提高生產(chǎn)力。

關于AppliedPhotophysics

英國應用光物理公司Applied Photophysics數(shù)十年來為生物藥的結(jié)構(gòu)與功能研究提供專業(yè)方案，產(chǎn)品包括圓二色CD光譜儀、停流stopped flow反應動力學分析儀、SUPR DSF蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析儀

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Chirascan系列圓二色CD光譜儀，廣泛應用于蛋白質(zhì)等生物藥的高級結(jié)構(gòu)表征，包括蛋白質(zhì)等的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)分析，以及二級結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性、三級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性研究。